CAR-T细胞制备的质效提升路径探讨
嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已改变淋巴瘤的治疗格局，但现行制备工艺存在诸多挑战，制约了其广泛应用。由于患者临床疗效受CAR-T细胞产品表型的影响，因此优化产品起始材料和生产工艺显得尤为关键。CAR-T细胞制备过程通常历时3-6周，涵盖患者白细胞采集、T细胞分离与富集、T细胞活化、CAR基因转导、体外扩增、质控分析、冷冻保存以及运输等环节，最后回输至患者体内。本文探讨了提高CAR-T细胞产品质量以及缩短制备周期的研究进展，旨在充分发挥CAR-T细胞疗法的临床潜力[1]。
1. 缩短白细胞单采时间
制备CAR-T细胞的患者自体材料是通过白细胞采集获得的。但白细胞采集能力有限阻碍了CAR-T细胞疗法的广泛应用。首先，白细胞采集所需资源众多，包括工作人员、病床、机器空间和实验室等，且成本昂贵。此外，约有74%患者在白细胞采集时实际花费时间比所需时间更长，收集的细胞数量也超过了成功制备CAR-T细胞所需的数量。一项研究设计了一种算法，根据患者白细胞采集前的血液结果，可特异性地预测该过程所需时间，从而缩短白细胞采集的时间。随着T细胞活化和扩增技术的改进，未来有可能不再需要白细胞采集，而使用外周血作为CAR-T细胞制备的起始材料。
2. 细胞预筛选
在CAR-T细胞制备过程中，T细胞质量不佳和数量不足往往导致制备失败。为了优化CAR-T细胞功能，建议在制备前对细胞进行预筛选，或去除免疫抑制性细胞亚群，如血小板、红细胞、单核细胞、恶性B细胞、髓源性抑制细胞和调节性T细胞等。现有证据日益表明，分化程度较低T细胞的存在与CAR-T细胞治疗后的临床缓解和持久性密切相关。相较于效应细胞（包括效应记忆T细胞 [TEM]、效应T细胞 [TE] 和重新表达CD45RA的效应记忆T细胞 [TEMRA]），分化程度较低的T细胞（包括初始 (Naïve) T细胞 [TN]、干细胞样记忆T细胞 [TSCM] 和中央记忆T细胞 [TCM]）具有更强的增殖和细胞因子分泌能力。尽管预筛选策略具备诸多潜在优势，但也存在一些弊端，例如成本高昂以及需要额外的体外细胞处理步骤等。
3. 改良体外培养条件
在促增殖细胞因子（如IL-2）中进行长期培养的主要问题是，这一过程会导致分化程度较低的记忆T细胞丧失、T细胞代谢改变以及体内功能受损。除了诱导过度分化外，长期体外制备的另一个关键问题是诱导CAR-T细胞耗竭。研究表明，调整培养基成分可以改善CAR-T细胞的表型，其中IL-7和IL-15相较于IL-2更能有效防止T细胞分化。为了增加CAR-T细胞产品中记忆表型T细胞比例并减少T细胞耗竭，一些研究在CAR-T细胞制备过程中使用了T细胞信号通路的小分子抑制剂。有研究表明，AKT抑制能够产生富含TSCM或TCM的CAR-T细胞产品，这些产品在白血病的临床前模型中展现出了显著的抗肿瘤活性。
4. 省略T细胞活化步骤
在传统的CAR-T细胞制备方案中，T细胞活化是实现逆转录病毒转染和提高静息期T细胞慢病毒转染效率的关键步骤。然而，T细胞活化会引起分化和扩增，最终可能导致不太理想的CAR-T细胞产物表型和功能。在一项临床前研究中，未活化的CAR-T细胞用于治疗免疫缺陷B细胞白血病异种移植小鼠模型，结果显示CAR-T细胞具有持久的抗肿瘤活性。总体而言，无活化的CAR-T细胞的制备可能会改善CAR-T细胞的表型和功能，防止终末分化和复制性衰老。然而，这些方案在临床生产环境中的可行性仍有待评估。
5. 缩短或省略T细胞扩增步骤
鉴于长期培养对T细胞表型和功能的不良影响，缩短或省略T细胞扩增的快速制造方案是临床研究的重点。一项I期临床研究评估了一种新型CD19 CAR-T细胞产品，该产品可以在2天内完成制备，同时保持T细胞的干细胞特性。该产品以12.5×106 CAR-T细胞剂量（比商业化CAR-T细胞剂量低10-50倍）治疗16例复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（R/R DLBCL）患者，结果显示，中位随访6个月时，患者的客观缓解率（ORR）为80%，3个月完全缓解（CR）率为73%[2]。
6. 缩短CAR-T细胞产品的质控和放行时间
尽管缩短周期的CAR-T细胞制备方案使患者可以更早地接受CAR-T细胞治疗，且CAR-T细胞产品质量可能更佳，但CAR-T细胞产品的质控速度仍然较慢，这些耗时的产品特性、纯度、安全性和活性测试可能导致时间延长。使用基于试剂盒的自动化仪器进行细菌污染检测是培养方法中更快、更可靠的替代方案。当转基因表达在细胞表面达到稳定水平时，可以通过流式细胞术对CAR-T细胞数量进行精确定量。扩增动力学数据的检测（例如实时荧光或基于阻抗的分析）对CAR-T的活性检测可能准确性更优。
7. 近患者制备和非冻存后回输
集中制备CAR-T细胞产品的后勤复杂性是一个值得关注的问题，床旁（Point-of-care）CAR-T细胞的制备可使CAR-T细胞治疗更快地应用于患者。在一项I期床旁（Point-of-care）制备CAR-T的临床研究中，CAR-T细胞制备历时14天，85%（22/26）的患者达到了目标剂量，其中14例患者接受了未冷冻保存的CAR-T细胞（从单采到CAR-T细胞回输共15天），7例患者接受了冷冻保存后复苏的CAR-T细胞。研究结果显示，未冷冻保存的CAR-T细胞扩增峰值显著高于冷冻保存CAR-T细胞产品，且ORR在数值上也更高（93% vs 57%，无统计学差异）。尽管在护理点制备可以加快患者获取CAR-T细胞产品，但其广泛应用仍面临诸多障碍，例如由于临床并发症（如发热或感染），不得不给予冻存、需要熟练技能的工作人员、对多地点的生产活动进行监控，以及确定护理点产品的质控和监管等。
8. 体内制备CAR-T细胞
选择性基因递送和体内靶细胞基因修饰的进步为体内CAR-T细胞制备创造了机会。一项临床前研究采用携带抗CD19 mRNA CAR的脂质纳米颗粒治疗人B淋巴细胞白血病肿瘤小鼠模型，结果表明，单次给药后，肿瘤可被快速清除，CAR在体内T细胞上表达。体内CAR-T细胞制备是一项重大突破，将来可能为患者的治疗带来变革。
小 结
通过调控细胞因子、应用小分子抑制剂以干预T细胞表型有望提升CAR-T细胞产品质量。同时，缩短制备、质控检测环节以及CAR-T细胞产品放行时间的策略，有望实现更高效率的CAR-T细胞产品的生产。
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