研究共纳入了20例未接受任何治疗的初诊B-NHL患者（化疗前组）和24例既往接受过治疗的B-NHL患者（中位治疗线数为3线，化疗后组）的外周血样本。B-NHL具体包括弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、套细胞淋巴瘤（MCL）和滤泡性淋巴瘤（FL）。

化疗会引发T细胞亚群组成的显著变化，并伴随着转录谱的改变。治疗后患者的T细胞呈现出向更高度分化表型倾斜的趋势，同时检测到表明T细胞耗竭的标志物表达上调。化疗会使T细胞处于一种更为疲惫、功能受损的状态，从而可能影响CAR-T细胞疗法的效果。研究通过对比B-NHL患者化疗前后的T细胞表型特征，评估化疗对CAR-T细胞疗法中T细胞功能的影响。结果表明，化疗后患者的CD4/CD8 T细胞比值显著降低（p＜0.01），而既往研究表明CD4/CD8 T细胞比值较高与CAR-T细胞疗效好相关。同时，化疗导致T细胞分化状态改变：初始T细胞（CCR7⁺CD45RA⁺）比例显著减少（p＜0.001），效应记忆T细胞（CCR7^-CD45RA^-）比例显著增加（p＜0.01）。进一步通过聚类分析显示，聚类3（p＜0.001）和聚类9（p＜0.05）的化疗前和化疗后存在显著性差异。聚类3以化疗前的CD4⁺ T细胞为主，不表达耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3和TIGIT），而聚类9则富集化疗后的CD8⁺ T细胞，其表达的衰竭标记物水平最高。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析揭示了化疗后T细胞中与功能降低相关的基因表达。结果显示，与化疗前相比，化疗后T细胞中有29个基因的表达显著升高，118个基因的表达显著降低（adj.p<0.05, abs(logFC)>0.58）。一些表达升高的基因参与T细胞活化（CD70、OASL）、细胞耗竭（SP140）、细胞迁移减少（RGS9）和细胞凋亡（LGALS1）。而化疗前表达较高的一些基因在T细胞存活（HIVEP2、ZNF667）、增殖（TGFA、MPP1）和迁移（ITGA6）方面发挥作用。

为明确可能导致T细胞功能障碍的通路，研究分析了化疗后样本中富集的配体-受体相互作用。发现CD4与MHC II类分子（HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DRB5）相互作用较强，这些相互作用对T细胞的活化至关重要，提示化疗后T细胞的活化表型增强。此外，涉及 LGALS1 的两种相互作用也得到富集，鉴于 LGALS1 编码的 galectin-1 在促进 T 细胞凋亡方面中的作用，可能表明化疗后 T 细胞对凋亡的敏感性增加。

DNA甲基化分析揭示了化疗后T细胞中与功能降低相关的表观遗传变化。结果显示，化疗前后T细胞的甲基化模式呈现明显分离。共发现88958个差异甲基化位点（DMP），其中化疗后16764个DMP甲基化水平升高，72194 个DMP甲基化水平降低（adj.p<0.05，abs(logFC)>0.2）。此外，在化疗后样本的低甲基化CpGs位点中，部分甲基化结构域（PMD）富集，提示T细胞已处于活化和分化状态。

研究进一步分析化疗后DNA甲基化与CAR-T细胞反应的相关性，发现EPICART特征的四个单CpG位点与生存率提高直接相关，且这些位点在化疗前T细胞中甲基化水平更高。表明化疗会导致T细胞表观遗传学改变，与T细胞功能障碍及对CAR-T细胞疗法反应不佳密切相关。

对CAR转导和CAR-T细胞扩增后的T细胞进行全基因组甲基化分析发现，化疗前和化疗后的表观遗传学差异仍较明显。应用EPICART特征分析CAR-T细胞甲基化数据，表明即使在转导和扩增之后，由化疗前T细胞制备的 CAR-T细胞仍具有与疗效更好相关的表观遗传特征。

化疗可能会削弱CAR-T细胞对肿瘤细胞的攻击能力，进而影响患者的治疗预后。在体外细胞毒性实验中，来自化疗前患者的CAR-T细胞展现出了显著优于化疗后患者的CAR-T细胞的杀伤效能。化疗前后的T细胞活性相似，平均活性均都在90%以上。然而，尽管两组的CAR-T细胞在初始刺激时能够裂解相似数量的肿瘤细胞，但在反复刺激后，由化疗后T细胞制备的CAR-T细胞显示累积杀伤能力降低，而由化疗前T细胞制备的CAR-T细胞对抗原反复刺激表现出更好的疗效和持久性。

综上所述，采用化疗前收集的T细胞进行CAR-T细胞制备，可增强CAR-T细胞治疗B-NHL患者的疗效和持久性，改善患者的预后。对于临床实践而言，这项研究的发现具有重要的启示意义。一方面，可以在高危患者开始一线治疗前，加入T细胞保存步骤，以便后续能获得更优质的CAR-T细胞制备原料。另一方面，该研究结果也有力地支持了目前正在进行的将CAR-T细胞疗法纳入一线高危B-NHL治疗方案的相关临床研究。未来，随着我们对T细胞在CAR-T细胞疗法中作用的进一步深入理解，有望开发出更优化的治疗策略，使更多的淋巴瘤患者能够从这一创新疗法中获益。